Hepatocellular carcinoma

Это не статья, просто собрание разных ссылок, сделанное по техническим причинам

 

Hepatocellular carcinoma redirects to ketolysis for progression under nutrition deprivation stress

Abstract

Cancer cells are known for their capacity to rewire metabolic pathways to support survival and proliferation under various stress conditions. Ketone bodies, though produced in the liver, are not consumed in normal adult liver cells. We find here that ketone catabolism or ketolysis is re-activated in hepatocellular carcinoma (HCC) cells under nutrition deprivation conditions. Mechanistically, 3-oxoacid CoA-transferase 1 (OXCT1), a rate-limiting ketolytic enzyme whose expression is suppressed in normal adult liver tissues, is re-induced by serum starvation-triggered mTORC2-AKT-SP1 signaling in HCC cells. Moreover, we observe that enhanced ketolysis in HCC is critical for repression of AMPK activation and protects HCC cells from excessive autophagy, thereby enhancing tumor growth. Importantly, analysis of clinical HCC samples reveals that increased OXCT1 expression predicts higher patient mortality. Taken together, we uncover here a novel metabolic adaptation by which nutrition-deprived HCC cells employ ketone bodies for energy supply and cancer progression.

Гепатоцеллюлярная карцинома перенаправляет к кетолизу для прогрессирования в условиях стресса недоедания

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5113304/?fbclid=IwAR1gSPGH1riLiFqZHTcoD8Pgv-lDUQSW5R5QBBnZgpYGeEZBBShuyMa2uEo \

 

Аннотация

Раковые клетки известны своей способностью перестраивать метаболические пути для поддержки выживания и пролиферации в различных стрессовых условиях. Кетоновые тела, хотя и вырабатываются в печени, не потребляются в нормальных взрослых клетках печени. Здесь мы находим, что катаболизм кетонов или кетолиз повторно активируется в клетках гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК) в условиях недостаточного питания. Механистически, 3-оксокислотная КоА-трансфераза 1 (OXCT1), ограничивающий скорость кетолитический фермент, экспрессия которого подавлена в нормальных тканях взрослой печени, индуцируется с помощью запускаемой сывороточным голоданием передачи сигналов mTORC2-AKT-SP1 в клетках HCC. Кроме того, мы наблюдаем, что усиленный кетолиз в HCC является критическим для подавления активации AMPK и защищает клетки HCC от чрезмерной аутофагии, тем самым усиливая рост опухоли. Важно отметить, что анализ клинических образцов ГЦК показывает, что повышенная экспрессия OXCT1 предсказывает более высокую смертность пациентов. Взятые вместе, мы раскрываем здесь новую метаболическую адаптацию, благодаря которой клетки ГЦК, лишенные питания, используют кетоновые тела для снабжения энергией и развития рака.

Ключевые слова: кетоновые тела, ГЦК, OXCT1, АКТ, АМПК, аутофагия

Идти к:

Вступление

По сравнению с их нормальными аналогами, раковые клетки метаболически перепрограммированы, чтобы получить достаточную энергию или дополнительные стимулы для поддержки быстрого роста и пролиферации клеток1,2. В то время как раковые клетки, как известно, непропорционально потребляют глюкозу, глютамин и жирные кислоты для энергии, а также источники углерода и азота для анаболизма, во время развития опухоли часто происходит ограничение питательных веществ. Появляется все больше доказательств того, что раковые клетки широко открыты для дополнительных источников питательных веществ в условиях ограничения питания3. Две группы недавно сообщили, что различные типы рака активно потребляют ацетат, чтобы стимулировать рост рака 4,5,5. Совсем недавно, Loo et al. 7 подтвердили, что метастатические колоректальные раковые клетки полагаются на креатин внеклеточного метаболита для облегчения метастазирования и прогрессирования рака. Кроме того, в дополнение к ранним сообщениям, в которых рециркуляция лактата считалась важным источником топлива для прогрессирования рака8,9, последнее исследование показало, что накопленный лактат способствует передаче сигналов гипоксии, чтобы стимулировать рост рака10. Все вместе эти важные результаты указывают на тревожную возможность того, что многочисленные, казалось бы, бесполезные метаболиты являются топливом для раковых клеток, что делает его широко открытым для изучения потенциальных альтернативных питательных веществ для опухолей, чтобы сформировать всеобъемлющую картину метаболизма рака.

Тело кетона состоит из трех отдельных малых молекул: ацетона, ацетоацетата (AcAc) и β-гидроксибутирата (β-HB). Продукция кетоновых тел, или кетогенез, в основном происходит в печени, где ацетил-КоА сначала превращается в AcAc, который затем катализируется β-гидроксибутиратдегидрогеназой (BDH1) с образованием β-HB. Хотя ацетон не может быть далее метаболизирован с образованием АТФ, AcAc и -HB экспортируются в кровоток и потребляются внепеченочными тканями, такими как мышцы, почки или мозг11. Следует отметить, что кетоновые тела также могут проходить через гематоэнцефалический барьер, попадая в мозг, чтобы служить основным источником энергии во время голодания12. При катаболизме кетонового тела или кетолизе β-HB окисляется обратно в AcAc также BDH1. Затем сукцинил-КоА жертвует свой КоА AcAc с образованием ацетоацетил-КоА (AcAc-CoA), реакции, ограничивающей скорость, катализируемой 3-оксокислотой КоА-трансферазой 1 (OXCT1, также известной как SCOT). Ацетил-КоА-ацетилтрансфераза 1 (АСАТ1) затем превращает AcAc-КоА в два ацетил-КоА, которые подают в цикл трикарбоновых кислот (ТСА) для производства АТФ13. Для всего организма кетоновые тела обеспечивают быстрый и эффективный способ снабжения энергией во время голодания, который связывает пищевые липиды или триглицериды жировой ткани с циклом TCA и дыхательной цепью. Как ключевой фермент кетолиза, OXCT1 экспрессируется в большом количестве в сердце, мозге и почках; однако обнаружено, что его экспрессия репрессируется в клетках взрослой печени и клетках печени14,15, в значительной степени рассматриваемых как механизм предотвращения бесполезного цикла синтеза кетонового тела и катаболизма в одной и той же ткани. Следовательно, хотя хорошо известно, что печень является основной фабрикой по производству кетонового тела, на сегодняшний день нет документации, показывающей, что клетки печени взрослого человека могут использовать кетоновые тела в качестве источников энергии, по крайней мере, насколько нам известно

Недавно мы исследовали метаболическую адаптацию клеток гепатоцеллюлярной карциномы человека (ГЦК) в различных стрессовых условиях16,17,18. Мы обнаружили cMyc-опосредованную активацию пути синтеза серина, когда глюкоза или глутамин лишены18, и HIF-1-опосредованное подавление β-окисления жирных кислот при дефиците кислорода16. Дальнейший скрининг изменений генов, связанных с метаболизмом липидов, привел нас к удивительному наблюдению, что основной фермент кетолиза, OXCT1, резко индуцируется в клетках ГЦК, лишенных питания. Известно, что OXCT1 широко экспрессируется в эмбриональной печени; однако его экспрессия исчезает в печени взрослого человека, что было предположено в качестве основной причины отсутствия потребления кетоновых тел у взрослых печени19. Следовательно, выявление высокой экспрессии OXCT1 в клетках HCC привело нас к гипотезе о том, что раковые клетки печени, такие как клетки печени плода или мозг, могли бы использовать кетоновые тела для подпитки роста клеток в условиях, ограничивающих питание, которые на самом деле , являются неизбежными обстоятельствами во время развития рака. В этом исследовании наши результаты показали, что недостаток питания способствует метаболическому перепрограммированию клеток ГЦК, стимулируя экспрессию OXCT1 и, как следствие, использование кетонового тела для снабжения энергией. Дальнейшие исследования показали, что выработка АТФ в кетоновом теле снижает фосфорилирование АМФК и аутофагию во время дефицита питания. В совокупности активация OXCT1 в раковых клетках печени облегчает использование кетонового тела в качестве корыстного источника топлива для роста клеток при ограничении питания. Эти результаты открывают путь для лечения пациентов с ГЦК путем использования метаболизма в организме с нарушенной регуляцией кетонов.

Результаты

Кетолиз повторно активируется в клетках ГЦК с недостаточным питанием для облегчения пролиферации клеток

Наша недавняя работа показала, что β-окисление жирных кислот в раковых клетках ингибируется, чтобы ослабить окислительный стресс и активировать пролиферативную передачу сигналов в условиях гипоксической микросреды16. Мы также исследовали метаболические изменения липидов в условиях, ограничивающих питание. Сначала мы культивировали клетки HepG2 человека в условиях недостатка глюкозы, глютамина или сыворотки и выполнили обратную транскрипцию и количественную ПЦР в реальном времени (qRT-PCR) для анализа экспрессии генов, связанных с метаболизмом липидов. Интересно, что мы обнаружили, что несколько основных генов, ответственных как за кетогенез, так и за кетолиз, заметно изменяются при голодании в сыворотке (рис. 1А). Хотя неудивительно, что экспрессия генов, связанных с кетогенезом, таких как BDH1 и HMG-CoA-синтаза 2 (HMGCS2), активировалась в клетках печени в ответ на голод 20, 21, было неожиданным, что OXCT1, который кодирует ключевой фермент кетолиз был значительно выражен в клетках HepG2 при сывороточном голодании по сравнению с нормальными условиями культивирования (фиг. 1А). В соответствии с результатами qRT-PCR, истощение сыворотки, но не глюкозы или глютамина, заметно стимулировало экспрессию белка OXCT1 в различных клеточных линиях HCC, включая клетки HepG2, Hep3B и PLC (рис. 1B и дополнительная информация, рис. S1A). BDH1, который катализирует обратимую реакцию как в кетогенезе, так и в кетолизе, также активировался в условиях голодания в сыворотке (Рисунок 1A, 1B1B и Дополнительная информация, Рисунок S1A). Мы также наблюдали, что сывороточное голодание повышало уровни белка OXCT1 и BDH1 в зависимости от времени в клетках HepG2, Hep3B и PLC (рис. 1C и дополнительная информация, рис. S1B), но не в нетрансформированной клеточной линии печени THLE322 ни у одного белка или уровни мРНК (фигура 1C и дополнительная информация, фигура S1C), указывающие на то, что голодание в сыворотке специфически активирует экспрессию OXCT1 и BDH1 в клетках рака печени.

Индукция экспрессии как BDH1, так и OXCT1 в результате депривации сыворотки, двух ключевых ферментов катаболизма β-HB в митохондриях, позволяет предположить активацию кетолиза в раковых клетках печени, страдающих от истощения сывороткой. Таким образом, мы отслеживали метаболический поток кетонового тела с использованием 13C-меченого [2, 4-13C2] β-HB методом газовой хроматографии-масс-спектрометрии (ГХ-МС). Наши результаты показали, что голодные в сыворотке клетки HepG2 быстро приобрели способность катаболизировать 13C-меченный β-HB в различные метаболиты цикла TCA, такие как цитрат, сукцинат, фумарат, малат, глутамат и аспартат, в то время как клетки HepG2 без сыворотки почти не использовали β-HB (рис. 1D). Аналогичные результаты наблюдались в клетках Hep3B и PLC (дополнительная информация, рис. S1D), и маркировка устойчивых состояний метаболитов TCA 13-меченным β-HB происходила между 24 и 48 часами (данные не показаны). В соответствии с предыдущими сообщениями14,19, нормальные клетки печени THLE3 не способны метаболизировать β-HB при любом условии (рис. 1D и дополнительная информация, рис. S1E). Интересно, что истощенные сывороткой клетки HepG2 катаболизируют больше β-HB, когда глюкоза и глютамин одновременно снижаются в культуральной среде (дополнительная информация, рисунок S1E). Эти результаты с использованием метаболического отслеживания 13C-меченого β-HB в совокупности позволяют предположить, что увеличенная доля производного β-HB ацетил-CoA, входящего в цикл TCA, продуцирует АТФ при депривации сыворотки в клетках HCC (Figure 1E). Действительно, добавление экзогенного β-HB постепенно восстанавливало клеточные уровни АТФ в клетках HepG2, лишенных сыворотки, но не в клетках THLE3 (Figure 1F). Кроме того, хотя дополнительный β-HB не оказывал влияния на пролиферацию клеток HepG2 в нормальных условиях культивирования, он значительно способствовал пролиферации голодных в сыворотке клеток HepG2 (рис. 1G), демонстрируя, что клетки HCC адаптируются к стрессу истощения питания, используя β-HB в качестве источник энергии для облегчения роста клеток.

 

OXCT1 имеет решающее значение для индукции кетолиза в клетках ГЦК с дефицитом питания

В частности, мы попытались определить, какой фермент (ы) является критически ответственным за катаболизм кетонового тела, вызванный голоданием пищи, в клетках ГЦК. Сначала мы создали стабильные клеточные линии HepG2, в которых экспрессия BDH1 или OXCT1 была снижена с помощью специфических shRNAs (рис. 2A и дополнительная информация, рис. S2A) и культивировали клетки с [2, 4-13C2] β-HB. Анализ GC-MS показал, что нокдаун BDH1 или OXCT1 уменьшал стимулируемый сывороточным голоданием разговор [2, 4-13C2] β-HB с метаболитами цикла TCA в клетках HepG2 (фигура 2A и дополнительная информация, фигура S2A), демонстрируя, что оба BDH1 и OXCT1 необходимы для кетолиза β-HB в стрессовых условиях. С другой стороны, принудительная экспрессия BDH1 или OXCT1 в клетках HepG2 резко снижала концентрацию добавленного β-HB в культуральной среде (рис. 2B), подтверждая, что как BDH1, так и OXCT1 стимулировали клеточное поглощение β-HB. Дальнейший анализ показал, что принудительная экспрессия BDH1 увеличилась, в то время как OXCT1 снизился, внутриклеточный уровень AcAc в клетках HepG2, подтвердив, что BDH1 и OXCT1 последовательно катализируют потребление β-HB (рис. 2C). Однако очень интересно наблюдать, что только сверхэкспрессия OXCT1, но не BDH1, заметно способствует катаболизму [2, 4-13C2] β-HB в метаболиты цикла TCA в клетках HepG2, Hep3B и THLE3 (Figure 2D, 2E2E) и дополнительная информация, рисунок S2B). Учитывая, что OXCT1 отсутствует, в то время как BDH1 в изобилии присутствует в нормальных тканях печени (дополнительная информация, рисунок S2C) или при нормальной культуре14, мы пришли к выводу, что именно индукция экспрессии OXCT1, но не экспрессия BDH1, была ответственна за реактивация кетолиза в истощенных сывороткой клетках ГЦК, хотя оба фермента катализируют ограничивающие скорость стадии кетолиза. Следовательно, мы в дальнейшем сфокусировали наше исследование на OXCT1.

Большая часть кетогенеза происходит в митохондриях клеток печени, где ацетил-КоА последовательно катализируется HMGCS2 и HMGCL с образованием AcAc и β-HB23. Действительно, наши данные показали, что уровни белка HMGCS2 были повышены в клетках HCC (включая HepG2 и Hep3B), а также в нормальных клетках печени (THLE3) при сывороточном голодании (дополнительная информация, рисунок S2D), что позволяет предположить, что как нормальные клетки, так и клетки HCC были способен генерировать кетоновые тела. Дальнейший анализ клеточного β-HB и AcAc показал, что сывороточное голодание повышало уровни обоих кетоновых тел в клетках HepG2 (дополнительная информация, рисунок S2E), что указывает на усиление кетогенеза при сывороточном голодании в клетках HCC. Более того, нокдаун OXCT1 приводил к дальнейшему накоплению как β-HB, так и AcAc при голодании в сыворотке (дополнительная информация, рисунок S2E), демонстрируя, что кетоновые тела, продуцируемые клетками HCC, могут использоваться самими собой, когда экспрессия OXCT1 индуцируется в условиях истощения питания ,

 

Мы наблюдали постепенное снижение клеточных уровней АТФ из-за голодания в сыворотке в клетках HepG2, которое было дополнительно снижено после нокдауна OXCT1 (Figure 2F). Соответственно, нокдаун OXCT1 с помощью shRNAs не оказывал очевидного влияния на пролиферацию клеток в нормальных условиях, но полностью блокировал рост клеток в клетках HepG2, лишенных сыворотки (Figure 2G). Более интригующе, когда экспрессия OXCT1 была восстановлена в клетках HepG2 с нокдауном OXCT1, уровни АТФ, а также рост клеток были значительно восстановлены при голодании в сыворотке (Figure 2H and and 2I) .2I). Подобные результаты также наблюдались в клетках Hep3B (дополнительная информация, фигуры S2F и S2G). Поскольку эти результаты были получены, когда в культуральную среду не был включен экзогенный β-HB, мы предположили, что клетки с экспрессией OXCT1 могут использовать кетоновые тела, полученные сами по себе, поскольку гепатоциты хорошо известны как основной источник продукции кетоновых тел. и наши результаты также показали усиление продукции кетоновых тел при сывороточном голодании (дополнительная информация, рисунок S2E). Чтобы напрямую проверить эту гипотезу, мы манипулировали экспрессией HMGCS2, критического кетогенного фермента, и результаты показали, что, когда производство тела кетона было подавлено нокдауном HMGCS2, стимулированная OXCT1 клеточная пролиферация была в значительной степени отменена (дополнительная информация, рисунок S2H и S2i). Интересно, что в присутствии экзогенного β-HB избыточная экспрессия OXCT1 все еще может способствовать пролиферации клеток в HMGCS2-нокдаун-клетках HCC (дополнительная информация, рисунок S2I). Взятые вместе, эти данные демонстрируют, что экспрессия OXCT1 является критической для поддержания клеточного АТФ-гомеостаза посредством кетолиза для поддержания пролиферации клеток в клетках ГЦК, особенно при голодании.

Активация передачи сигналов mTORC2-AKT-SP1 индуцирует экспрессию OXCT1 и кетолиз в клетках HCC, ограничивающих питание

Затем мы исследовали механизм, с помощью которого сывороточное голодание активирует экспрессию OXCT1 и кетолиз в клетках HCC. Как сообщалось ранее 24,25,26,27, мы наблюдали, что уровни фосфорилирования AMPK, AKT1 и ERK1 / 2 быстро увеличивались в ответ на голодание сыворотки в клетках HepG2 (Figure 3A). В соответствии с предыдущими сообщениями, что голодание в сыворотке стимулировало активность NF-κB28, мы обнаружили ускоренную деградацию IκBα в клетках HepG2 с истощением сыворотки, что указывает на потенциальную активацию NF-κB (рис. 3А). Чтобы идентифицировать пути, которые могут быть вовлечены в вызванную голоданием в сыворотке экспрессию OXCT1, мы обрабатывали клетки HepG2 различными ингибиторами в условиях депривации сыворотки, включая соединение C (ингибитор AMPK), LY-294002 (ингибитор PI3K / AKT), PD98059 ( ингибитор MEK, который является предшествующим эффектором Erk-1/2), EVP4593 (ингибитор NF-κB) и Z-VAD-FMK (ингибитор апоптоза). Удивительно, но только LY-294002 заметно ослабил вызванную голоданием в сыворотке мРНК и экспрессию белка OXCT1 (рис. 3В). Кроме того, нокдаун AKT специфическими shRNAs блокировал активацию OXCT1 как на уровне мРНК (дополнительная информация, рисунок S3A), так и на уровне белка (рисунок 3C) в условиях сывороточного голодания в клетках HepG2, демонстрируя, что AKT участвует в акПоскольку сообщалось, что mTORC2 стимулирует фосфорилирование AKT по серину 47329, мы обработали клетки HepG2 рапамицином для активации mTORC2. Результаты показали, что уровень экспрессии OXCT1 повышался при обработке рапамицином в клетках HepG2 (фигура 3D). Нокдаун Rictor, важного компонента комплекса mTORC2, отменил индукцию фосфорилирования AKT на серине 473 (дополнительная информация, рисунок S3B) и экспрессию OXCT1 (рисунок 3E) с помощью голодания в сыворотке, дополнительно демонстрируя, что mTORC2 действует выше фосфорилирования AKT и OXCT1 индукция при сывороточном голодании.

 

Предыдущий отчет показал, что область промотора OXCT1 содержит две последовательности GC-box, которые являются потенциальными сайтами связывания фактора транскрипции SP115; однако точный вклад этих последовательностей GC-box в транскрипцию OXCT1 не был полностью изучен. Наш вестерн-блот и анализ qRT-PCR выявили, что нокдаун SP1 с помощью shRNAs или блокирование транзактивности SP1 с помощью специфического ингибитора SP1 митрамицина A (MIT) значительно снижали уровень экспрессии OXCT1 в клетках HepG2, лишенных сыворотки (Рисунок 3F и дополнительная информация, Рисунок S3C). Кроме того, принудительная экспрессия SP1 усиливала экспрессию OXCT1 в клетках HepG2 (рисунок 3G), что позволяет предположить, что SP1 участвует в регуляции OXCT1. Затем мы вставили промоторную область OXCT1 или фрагменты GC-box (дополнительная информация, рисунок S3D) в репортерные плазмиды и провели двойной люциферазный анализ. Сывороточное голодание значительно усиливало люциферазную активность репортера-промотора OXCT1, которое было ослаблено нокдауном SP1 (фиг. 3H). Кроме того, принудительная экспрессия SP1 усиливала активность двух репортеров люциферазы, содержащих GC-бокс дикого типа (wt), но не содержащих GC-бокс мутанта (mt) (рис. 3I), предполагая, что SP1 стимулирует экспрессию OXCT1 посредством нацеливание этих последовательностей GC-box в промоторных областях OXCT1 при голодании в сыворотке. Анализ ChIP далее подтвердил, что SP1 связывается с этими GC-box мотивами в клетках HepG2, что постепенно усиливалось при отмене сыворотки (Figure 3J), указывая на то, что OXCT1 является прямой транскрипционной мишенью для SP1. Взятые вместе, эти данные демонстрируют, что SP1 связывается с промотором OXCT1 и активирует экспрессию OXCT1 в истощенных сывороткой клетках.

 

Известно, что АКТ, как киназа, фосфорилирует SP1, что приводит к активации SP130. Наш вестерн-блот анализ показал, что фосфорилирование треонина 453 на SP1 заметно усиливалось истощением сыворотки, которое блокировалось ингибированием AKT с LY-294002 в клетках HepG2 (дополнительная информация, рис. S3E и S3F), предполагая, что AKT активировал SP1 при голодании в сыворотке , Более того, принудительная экспрессия конститутивно активной миристоилированной AKT (myr-Akt) приводила к усиленному фосфорилированию SP1 и экспрессии белка OXCT1 в клетках HepG2 (рис. 3K). Важно отметить, что нокдаун SP1 с shRNAs отменял индукцию экспрессии OXCT1 myr-Akt (Figure 3K), предоставляя доказательства того, что SP1 действует ниже AKT в регуляции OXCT1. Взятые вместе, эти данные демонстрируют, что путь AKT, активируемый mTORC2 в условиях сывороточного голодания, транскрипционно стимулирует экспрессию OXCT1 через фосфорилирование SP1 (Figure 3L). Кроме того, метаболический анализ с помощью GC-MS показал, что нокдаун AKT или SP1 устранял индуцированный голодным сывороткой катаболизм [2, 4-13C2] β-HB в метаболиты цикла TCA в клетках HepG2 (фиг.3M), подтверждая, что AKT и SP1 имеют решающее значение для активации кетолиза в лишенных сыворотки клеток ГЦК. Следует отметить, что мы не наблюдали фосфорилирования АКТ в серине 473 и фосфорилирования SP1 в треонине 453 в клетках HepG2 в условиях голодания по глюкозе или глутамину (дополнительная информация, рисунок S3G), что согласуется с нашими выводами о том, что индукция экспрессии OXCT1 была ограничено стрессом сывороточного голодания в клетках ГЦК (рис. 1А и 1В1В).тивации OXCT1 в питании ограничивающие клетки HCC.

Кетолиз подавляет активацию AMPK и аутофагию в клетках ГЦК с недостаточным питанием, повышая выработку АТФ

Аутофагия активируется в качестве клеточного защитного механизма для поддержания выживания клеток во время сывороточного голодания31,32. Однако длительная или чрезмерная аутофагия может в конечном итоге привести к неапоптотической гибели клеток, запрограммированных по типу II33,34. Чтобы выяснить, участвует ли OXCT1 в регуляции аутофагии при депривации сыворотки, мы проанализировали накопление белка LC3-II, отличительного признака аутофагии. Результаты вестерн-блоттинга показали, что индуцированное голоданием в сыворотке накопление LC3-II было дополнительно усилено нокдауном OXCT1 в клетках HepG2 (фиг.4А). Аутофагию также анализировали путем трансфекции клеток HepG2 слитым белком GFP-LC3 (фиг.4В). В соответствии с результатами вестерн-блоттинга нокдаун OXCT1 увеличил процент клеток, демонстрирующих точечную флуоресценцию при сывороточном голодании (рис. 4B), подтверждая, что нокдаун OXCT1 способствует клеточной аутофагии в стрессовых условиях. С другой стороны, восстановление экспрессии OXCT1 в клетках HepG2 с нокдауном OXCT1 предохраняло клетки от аутофагии, вызванной депривацией сыворотки, что оценивалось по уровню белка LC3-II, а также по пункту флуоресценции GFP-LC3 (Рис. 4C и and4D), 4D), подчеркивая защитный эффект OXCT1 путем ограничения аутофагии при депривации сыворотки. Однако AICAR, активатор AMPK, отменил защитный эффект сверхэкспрессии OXCT1 в клетках HepG2 (Figure 4C and andDD, 4D), предполагая, что путь AMPK может быть вовлечен в OXCT1-регулируемую аутофагию при голодании в сыворотке.

AMPK является ключевым датчиком энергетического статуса и активируется в ответ на повышенные клеточные отношения AMP / ATP после LKB1-опосредованного фосфорилирования консервативного остатка Thr17235,36. Сообщалось, что активация AMPK облегчает клеточную аутофагию37. В соответствии с предыдущими сообщениями, мы наблюдали повышенное фосфорилирование AMPK, что указывает на его активацию во время голодания сыворотки (рис. 3А). Чтобы исследовать, участвует ли AMPK в аутофагии, регулируемой OXCT1 при голодании в сыворотке, мы провели вестерн-блоттинг для изучения Thr172 фосфорилирования AMPK в клетках HepG2. Мы обнаружили, что принудительная экспрессия OXCT1 ослабляла фосфорилирование AMPK, индуцированное голоданием в сыворотке, тогда как нокдаун OXCT1 повышал фосфорилирование AMPK при голодании в сыворотке, которое было отменено избыточной экспрессией OXCT1 обратно в клетки HepG2 (Figure 4E). Взятые вместе, эти данные предполагают, что путь AMPK участвует в OXCT1-регулируемой аутофагии в условиях дефицита питания в клетках HCC. Так как наши данные показали, что OXCT1 был критически важен для поддержания клеточных уровней АТФ путем катализа кетоновых тел в условиях питания (рис. 2F и 2H), 2H), мы затем изучили влияние добавки экзогенного β-HB на активацию AMPK, а также клеточная аутофагия в стрессовых условиях. Вестерн-блот анализ показал, что экзогенный β-HB ослаблял индуцированное голоданием в сыворотке фосфорилирование AMPK в контрольных клетках, но не в клетках HepG2, экспрессирующих shRNA OXCT1 (фигура 4F). Соответственно, белок LC3-II, а также точечный флуоресцентный анализ LC3 показали, что добавление экзогенных β-HB защищало клетки от аутофагии, вызванной депривацией питания, в контроле, но не в клетках HepG2, разрушающих OXCT1 (Figure 4F and and 4G4G).

 

Дальнейший анализ показал, что нокдаун AKT с помощью shRNA усиливал индуцированное голоданием в сыворотке фосфорилирование AMPK, накопление белка LC3-II и образование точечного GFP-LC3, которые были устранены принудительной экспрессией OXCT1 в клетках HepG2 (рис. 4H и andII). ). Эти данные согласуются с нашим наблюдением, что AKT действует выше OXCT1, регулируя его транскрипцию путем активации SP1 при голодании в сыворотке (Figure 3L). В совокупности наши данные показывают, что голодание в сыворотке стимулирует активацию AKT и его экспрессию OXCT1 в нижнем течении, что способствует катаболизму кетонового тела для поддержания гомеостаза клеточной энергии. Как следствие, активность AMPK была ингибирована для предотвращения чрезмерной аутофагии в клетках ГЦК с недостаточным питанием.

OXCT1 способствует прогрессированию ГЦК in vivo

Микросреда солидных опухолей обеспечивает сложную среду для выживания и роста опухолевых клеток, которая, среди прочего, характеризуется гипоксией, низким рН, питательным стрессом. Чтобы оценить влияние OXCT1 на пролиферацию раковых клеток in vivo, были проведены эксперименты с ксенотрансплантатом на голых мышах. Принудительная экспрессия OXCT1 в клетках HepG2 значительно ускорила рост его опухоли ксенотрансплантата (фигура 5A и дополнительная информация, фигура S4A). Вестерн-блоттинг показал, что опухоли, полученные из клеток HepG2 со сверхэкспрессией OXCT1, имели более низкие уровни LC3-II, чем контрольная группа (фиг.5B), что указывает на меньшую аутофагию в тканях опухоли ксенотрансплантата со сверхэкспрессией OXCT1, что согласуется с данными, полученными из клеток в культуре (фигура 5). 4C и and4D) .4D). С другой стороны, стабильный нокдаун OXCT1 с использованием shRNA заметно замедляет рост ксенотрансплантатов клеток HepG2 (рис. 5C и дополнительная информация, рис. S4B). Повышенные уровни LC3-II наблюдались в опухолевых тканях, генерируемых из клеток HepG2 с нокдауном OXCT1 (фиг. 5D), что дополнительно подчеркивает способность OXCT1 ограничивать аутофагию, благодаря которой он стимулирует раковые клетки адаптироваться к микроокружению опухоли.

Кетогенные диеты с высоким содержанием жиров и низким содержанием углеводов были изучены на различных моделях опухолей с точки зрения их влияния на онкогенез, включая рак легких и медуллобластому 38,39. Однако никогда не было документировано, влияют ли высокие уровни кетоновых тел на прогрессирование рака печени in vivo. Воодушевленные нашими результатами, согласно которым активация кетолиза через OXCT1 способствует пролиферации ГЦК как in vitro, так и in vivo, мы протестировали влияние кетогенной диеты на рост ГЦК на мышиной модели. Удивительно, но кетогенная диета не способствовала росту ГЦК независимо от гиперэкспрессии OXCT1 (дополнительная информация, рисунок S4C). Анализ содержания глюкозы и кетоновых тел у мышей показал, что, хотя кетогенная диета, которую мы использовали у мышей, приводила к более высоким уровням кетоновых тел в сыворотке, она также существенно снижала уровни глюкозы в сыворотке и массы тела мышей (дополнительная информация, рисунок S4D), что потенциально уменьшил снабжение глюкозой, которое способствует прогрессированию опухоли через эффект Варбурга. Следовательно, мы затем изменили нашу стратегию введения кетонового тела путем ежедневной внутрибрюшинной (внутрибрюшинной) инъекции β-HB. Наш анализ подтвердил повышенные уровни кетоновых тел в сыворотке, но никаких изменений уровней глюкозы и массы тела мышей после i.p. инъекция β-HB (дополнительная информация, рисунок S4E). Интересно, что мы наблюдали, что введение кетонового тела значительно стимулировало рост клеток HCC in vivo, когда OXCT1 был сверхэкспрессирован (Figure 5E). Вестерн-блот анализ также показал, что, подобно сверхэкспрессии OXCT1, введение β-HB также снижало уровни LC3-II в опухолевых тканях (фиг. 5F), подтверждая защитный эффект введения β-HB на выживаемость раковых клеток in vivo.

 

Аберрантная экспрессия OXCT1 предсказывает смертность пациентов при клиническом ГЦК

Затем мы исследовали потенциальную клиническую значимость повторной активации кетолиза в результате индуцированной экспрессии OXCT1 в развитии ГЦК. Сначала мы попытались определить уровни экспрессии β-HB и OXCT1 в сыворотке крови у пациентов с раком печени. Наши результаты показали, что у пациентов с ГЦК уровень β-HB в сыворотке значительно выше по сравнению с нормальными субъектами (рис. 6А). Связанные с кетолизом ферменты были также изучены в 20 парных очагах ГЦК и прилегающих образцах нераковой ткани. Среди ферментов только уровни мРНК OXCT1 были значительно увеличены в очагах ГЦК по сравнению с соседними нормальными тканями (рис. 6B и дополнительная информация, рис. S5A). Хотя экспрессия BDH1 увеличивается при сывороточном голодании в клеточных линиях ГЦК, мы не наблюдали существенной разницы в уровнях мРНК между очагами ГЦК и соседними нормальными тканями (дополнительная информация, рис. S5A). Кроме того, вестерн-блот анализ показал, что, помимо увеличения общего и фосфорилированного уровней SP1, как сообщалось ранее30, уровни белка OXCT1 были повышены в ткани ГЦК по сравнению с соседней нормальной тканью (рис. 6C).

обсуждение

Поскольку условия, ограничивающие количество питательных веществ, не редкость при развитии рака 40, нас интересует, какие пути или какое топливо могут обеспечить альтернативные источники для производства энергии в голодных раковых клетках. Используя скрининговый подход для определения изменений экспрессии генов, связанных с метаболизмом липидов, вызванных стрессами при питании, мы обнаружили, что уровень экспрессии OXCT1, ключевого фермента катаболизма кетонового тела, резко повышается в клетках рака печени, страдающих от сыворотки (Рисунок 1A) и and1B) .1B). Дальнейший анализ GC-MS показывает, что сывороточное голодание активирует катаболизм β-HB для производства энергии и прогрессирования рака в раковых клетках печени, но не в нормальных клетках печени или раковых клетках, культивируемых в нормальных условиях (Figure 1D and and1F) .1F). β-HB является наиболее распространенным в организме циркулирующим кетоновым телом и является «сверхтопливом», который сжигает более эффективно для производства энергии АТФ, чем глюкоза или жирные кислоты во время голодания41. Однако предыдущие исследования показали, что OXCT1 экспрессируется в эмбриональной печени мыши, а затем его экспрессия постепенно снижается во время созревания гепатоцитов19. Таким образом, несмотря на то, что печень является основным органом кетогенеза, печень мало экспрессирует OXCT1 по сравнению с другими органами. Поэтому обычно считается, что взрослые клетки печени не используют кетоновые тела для получения энергии из-за отсутствия экспрессии OXCT1. В настоящем исследовании очень интересно обнаружить, что экспрессия OXCT1 активируется с помощью передачи сигнала mTORC2-AKT-SP1, вызванной голоданием в сыворотке, в клетках HCC (Figure 3), что приводит к использованию кетоновых тел для продукции АТФ и пролиферации клеток посредством репрессии Активация AMPK и аутофагия (рисунок 4). Это открытие указывает на то, что раковые клетки печени потребляют кетоновые тела в качестве удобного топлива, способствующего выживанию и прогрессированию в стрессовых условиях. Короче говоря, мы раскрываем здесь перестроенный новый метаболический путь, посредством которого кетолиз повторно активируется в клетках ГЦК, ограничивающих питание, для снабжения энергией и прогрессирования рака.

 

Являясь единственным механизмом разрушения крупных структур, таких как органеллы и белковые агрегаты, аутофагия является эволюционно консервативным процессом в эукариотических клетках, которые питаются частями себя, чтобы выжить. Уровень аутофагии очень низок в условиях гомеостаза. Однако, когда клетки сталкиваются со стрессами окружающей среды, такими как недостаток питания или кислорода, аутофагия резко возрастает как механизм адаптации к общей выживаемости 42,43. Хотя все больше данных связывает аутофагию с раком, роль аутофагии в развитии рака все еще остается противоречивой. Ранние сообщения установили, что раковые клетки часто имеют более низкую аутофагическую способность или скорость деградации белка, чем их нормальные аналоги44. Трансгенные мыши с дефицитом аутофагии часто вызывали высокую заболеваемость раком легких, гепатоцеллюлярной карциномой и лимфомой, что свидетельствует о том, что нарушение регуляции аутофагии способствует онкогенезу 45,46. Тем не менее, значительная аутофагия действительно имела место в раковых клетках, лишенных аминокислот, глюкозы или кислорода, которые могут запускаться для защиты опухолевых клеток путем деградации поврежденных органелл33,47,48. Передача сигналов от чувствительных к энергии или питательным веществам AMPK имеет важное значение для восприятия питательными веществами пути аутофагии, подчеркивая ограничение энергии как основную причину аутофагии. Следовательно, мы предполагаем, что, если активация AMPK предназначена для ощущения низкоэнергетического стресса, запускающего деградацию клеточных компонентов, как определено аутофагии, для общей выживаемости популяции раковых клеток, лучшая стратегия адаптации раковых клеток к стрессам питания будет использовать дополнительные источники энергии, чтобы обойти аутофагии. В самом деле, мы наблюдали, что АМФК-опосредованная аутофагия была резко ослаблена индукцией OXCT1 в клетках ГЦК, лишенных сыворотки. Механистически, индукция OXCT1 способствует кетолизу, что приводит к повышению уровня АТФ и подавлению активности АМФК. Таким образом, здесь мы предлагаем новый механизм, посредством которого раковые клетки перестраивают метаболический путь для дополнительных источников энергии, чтобы обойти чрезмерную аутофагию во время развития рака.

Мы наблюдали, что кетогенез имеет решающее значение для выживания и пролиферации клеток HCC, стимулированных OXCT1, в условиях стресса (рис. 2). Когда HMGCS2, ограничивающий скорость фермент кетогенеза, был сбит с ног в отсутствие кетоновых тел в культуральной среде, преимущество роста, обеспечиваемое экспрессией OXCT1, было отменено. Добавление кетоновых тел в культуральную среду восстанавливало стимулированный OXCT1 рост клеток (дополнительная информация, рисунок S2I). Эти результаты показывают, что опосредованная OXCT1 выживаемость и рост ГЦК зависят от потребления кетоновых тел. Следует отметить, что клетки HCC, лишенные как HMGCS2, так и OXCT1, демонстрировали более низкую скорость пролиферации по сравнению с клетками, несущими оба (дополнительная информация, рисунок S2I). Этот результат говорит о том, что активный поток кетогенеза и кетолиза важен для оптимальной пролиферации клеток ГЦК, механизм которых требует будущих исследований. Возможно, что помимо модуляции уровней АТФ активный кетогенез и поток кетолиза могут оказывать более широкое влияние на развитие ГЦК. Например, в предыдущих докладах документировались роли передачи сигналов кетоновых тел посредством ингибирования HDAC49 или передачи сигналов GPR109A50. Кроме того, в соответствии со способностью OXCT1 катализировать превращение сукцинил-КоА в сукцинат, избыточная экспрессия OXCT1 приводила к повышению уровней как 13C-включенного сукцината, так и 12C-сукцината (дополнительная информация, рисунок S1F). Повышенный уровень 12С-сукцината потенциально представляет собой сукцинат-конвертированный сукцинил-КоА во время катаболизма β-НВ (дополнительная информация, рисунок S1G). Таким образом, необходимы дальнейшие исследования для изучения возможности того, что стимулированное OXCT1 повышение уровня сукцината и последующий метаболизм сукцината могут играть дополнительные проопухолевые роли.

 

Интересно, что мы определили mTORC2-AKT в качестве вышестоящего фактора, запускающего экспрессию OXCT1 в условиях голодания в сыворотке. АКТ является хорошо известным фактором выживания, активация которого способствует развитию ГЦК человека51. Стоит отметить, что, хотя сообщалось, что АКТ инактивируется лишением фактора роста при голодании в сыворотке крови52, абстиненция сыворотки также широко увеличивает фосфорилирование и активность АКТ в раковых клетках человека при различных условиях25, 27, 53, особенно в клетках гепатомы с истощением в сыворотке26. , Эти результаты согласуются с ролью АКТ в выживании. Хотя мы не могли исключить другие механизмы, которые могут быть вовлечены в поддержание экспрессии OXCT1, важно отметить, что мы предоставили несколько линий доказательств, чтобы четко установить регуляторную роль mTORC2-AKT-SP1-OXCT1 в реиндукции гепатоцеллюлярный кетолиз в раковых клетках (рис. 3C-3G, 3K3K и and3M) .3M). Одним из четко определенных механизмов, стимулирующих выживание AKT, является противодействие активации AMPK путем mTORC2-AKT-SP1 для подавления аутофагии54. Хан-Виндгассен и его коллеги впервые представили доказательства того, что АКТ снижала активность АМФК за счет повышения клеточных уровней АТФ55. Здесь мы представляем новые доказательства того, что mTOR-AKT-опосредованная индукция OXCT1 была достаточной для повышения клеточной продукции АТФ путем стимуляции катаболизма кетонового тела, что впоследствии уменьшало активность AMPK и ингибировало AMPK-опосредованную аутофагию в клетках рака печени с ограниченным питанием (Рисунок 7) , Наши новые результаты добавили еще один слой сложности к многогранной роли АКТ в продвижении выживания и пролиферации раковых клеток.

Анализы роста клеток in vitro и in vivo позволяют предположить, что экспрессия OXCT1 в клетках HCC способствует прогрессированию рака (фиг. 2G, 2I, 2I, 5A5A и and5C) .5C). Это очень интересно, учитывая, что экспрессия OXCT1 и кетолиз отсутствуют в нормальных гепатоцеллюлярных клетках, позиционируя OXCT1 в качестве потенциальной мишени для терапии ГЦК. Действительно, наши эксперименты с ксенотрансплантатом показали, что повышенные уровни кетонового тела значительно стимулировали рост клеток HCC in vivo, когда OXCT1 был сверхэкспрессирован (Figure 5E). Эти результаты побудили нас непосредственно изучить потенциальную клиническую значимость нерегулируемого метаболизма кетонового тела для развития ГЦК. Важно отметить, что мы наблюдали повышенные уровни β-HB в сыворотке у пациентов с ГЦК по сравнению с нормальным контролем (рис. 6А), что позволяет предположить, что кетоновые тела, вырабатываемые как злокачественными, так и нормальными тканями, легко доступны в качестве потенциального источника топлива для развития рака. Кроме того, мы наблюдали клиническую корреляцию аберрантной экспрессии OXCT1 с развитием ГЦК и выживаемостью пациентов, предполагая, что нерегулируемая экспрессия OXCT1 предсказывает смертность пациентов (рис. 6D-6F). Эта корреляция может быть очень важна для понимания патогенной роли нерегулируемого метаболизма кетонового тела во время развития рака печени, что дополнительно указывает на потенциальное обоснование для нацеливания на HCC-специфический путь OXCT1 в целом для терапии рака печени.

 

Идти к:

Материалы и методы

Клеточная культура и реагенты

Клетки HepG2, Hep3B, PLC, HEK293 и HEK293T человека культивировали в среде DMEM, содержащей 25 мМ глюкозы, 4 мМ L-глутамина и 1 мМ пирувата (Gibco, 12800). Клетки THLE3 культивировали в BEGM (LONZA, CC3170). Среда была дополнена 1% пенициллин-стрептомицином и 10% FBS. Для сывороточного голодания клетки дважды промывали PBS и культивировали в среде без FBS. DL-β-гидроксибутират (H6501), LY-294002 (L9908), PD98059 (P215), EVP4593 (SML0579) и AICAR (A9978) были приобретены у Sigma-Aldrich. Соединение C (Santa Cruz, sc-200689), Z-VAD-FMK (Selleck, S7023), рапамицин (Selleck, S1039), Митрамицин A (TOCRIS, 1489) также использовали для обработки клеток с носителем в качестве контроля.

 

QRT-ПЦР

Тотальную РНК выделяли с использованием тризола с последующей обработкой ДНКазой (Ambion) и обратной транскрипцией с помощью набора для синтеза кДНК iScript (Bio-Rad). qRT-ПЦР проводили с использованием мастер-смеси SYBR Green (Vazyme) на Bio-Rad iCycler. Использованные последовательности праймеров показаны в дополнительной информации, таблица S5. Все образцы были нормализованы до 18S рРНК.

Вестерн-блот

Клетки лизировали буфером RIPA и равные количества белка в лизатах кипятили и фракционировали с помощью 7-10% SDS-PAGE. Использовали первичные антитела против следующих белков: BDH1, OXCT1, OXCT2, ACAT1, ACAT2, SP1, HMGCS2, HMGCL и β-actin (от Proteintech); IκBα и NF-B (из Санта-Крус); AMPK, p-AMPK (Thr172), AKT, p-AKT (ser473), ERK1 / 2, p-ERK1 / 2 (Thr202 / Tyr204) (от Cell Signaling Technology); p-SP1 (Thr453), HMGCS2 (от Abgent); LC3 (Novus Biologicals). Сигнал был обнаружен с использованием субстрата Western ECL (Bio-Rad).

 

ГХ-МС анализ метаболитов

Клетки инкубировали в культуральной среде с добавлением 5 мМ [2, 4-13C2] -меченного β-гидроксибутирата (Sigma Aldrich, 674117) в указанных условиях. Метаболиты были извлечены из клеток, как описано ранее 56,57. Вкратце, каждую группу клеток собирали и немедленно замораживали мгновенно в жидком N2, метаболиты экстрагировали ледяным метанолом и лизаты центрифугировали при 18 000 × g в течение 15 минут для удаления белка. Супернатант высушивали в испарителе и ресуспендировали в 200 мкл пиридина. Метаболиты далее дериватизировали путем добавления 50 мкл MTBSTFA, содержащего 1% t-BDMCS, при 60 ° C в течение 1 часа. Образцы анализировали с использованием колонки Agilent 5MS в системе GC / MS Agilent 7890 / 5975C (Agilent Technologies, Santa). Пики, представляющие каждый метаболит, извлекали и интегрировали с использованием программного обеспечения MassHunter (Agilent Technologies). Данные 13C-меченых метаболитов представлены в виде процента от 13C-меченых метаболитов, который был рассчитан путем деления меченых ионов на общую интенсивность ионов. Этикетки не зависят от положения углерода. Распределение массовых изотопологов было скорректировано с учетом естественной численности. Мы использовали IsoCor, научное программное обеспечение, разработанное для экспериментов по мечению изотопов, чтобы исправить необработанные данные МС как для всех природных изотопов, так и для чистоты изотопного индикатора58. Веб-сайт для программного обеспечения (IsoCor): http://metasys.insa-toulouse.fr/software/isocor/.

 

Измерение клеточного АТФ

Уровни АТФ определяли с помощью набора для анализа АТФ на основе люциферин-люциферазы (Promega) с люминесцентным ридером (Promega). Люминесценция была нормализована к концентрации белка.

 

Плазмиды и создание стабильных клеток

shRNAs в векторе PLKO против OXCT1, BDH1, AKT, SP1 и Rictor были коммерчески приобретены (Sigma-Aldrich). Кодирующие последовательности человеческого OXCT1, BDH1, SP1 или GFP-LC3 субклонировали в лентивирусный вектор pSIN. OXCT1 также был вставлен в лентивирусный вектор флага pSIN-3 ×. Вектор pBabe-puro-myr-flag-AKT был приобретен у Addgene (Plasmid # 15294). Олигонуклеотидные последовательности shRNA таргетинга OXCT1 3’UTR (2 674-2 696) был вставлен в вектор PLKO на сайты EcoRI и AgeI (5′-CCGGAGGGCTGTGGGATAATTTACCCTCGAGGGTAAATTATCCCACAGCCCTTTTTTG-3 ‘, 5′-AATTCAAAAAAGGGCTGTGGGATAATTTACCCTCGAGGGTAAATTATCCCACAGCCCT-3′). Трансдукция и вирусная инфекция проводились, как описано ранее59.

 

Измерения β-HB и AcAc

Набор для анализа β-HB (Cayman) использовали для измерения внеклеточного β-HB в среде для культивирования клеток, а также внутриклеточного β-HB в клеточных лизатах. Внутриклеточный AcAc измеряли с использованием AcAc Assay Kit (BioVision). Все измерения следовали инструкциям производителя, и значения были нормализованы к концентрации белка.

 

Двойной люциферазный репортерный анализ

Промоторные последовательности человеческого OXCT1 встраивали в репортерный вектор базовой люциферазы pGL2 (Promega), обозначенный как промотор pGL2-OXCT1. Два GC-бокса и их мутированные последовательности были вставлены в репортерный вектор pGL2-промотора (Promega), в котором кодирующие последовательности люциферазы управлялись минимальным промотором SV40 и обозначались как pGL2-p-GCbox-1/2 wt и pGL2-GCbox -1/2 мут. Клетки HEK293 высевали в 48-луночный планшет. После инкубации в течение ночи клетки совместно трансфицировали 100 нг плазмиды-репортера люциферазы светлячка, 4 нг плазмиды pSV-Renilla и указанными плазмидами с последующим культивированием в нормальной или бессывороточной среде. Активность люциферазы измеряли с использованием системы анализа репортеров с двойной люциферазой (Promega). Активность люциферазы светлячка была нормализована к активности люциферазы рениллы.

Chip-анализ

Анализ на ChIP проводили с использованием набора EZ-ChIP (Millipore), следуя инструкциям производителя. Вкратце, клетки обрабатывали ультразвуком с помощью Bioruptor Sonication System UCD-300. ДНК подвергали иммунопреципитации антителом IgG кролика или SP1 (Proteintech) с последующим анализом qRT-PCR с использованием следующих праймеров: SP1 GCbox-1-forward: 5’-TGAGGCGCTGAGAGGAACTT-3 ‘, GCbox-1-reverse: 5’-TCGACAGCGCGTCGATGACGT- 3 ‘GCbox-2 вперед: 5′-CACTTCTTTTAAAAGCAGCAGCC-3′, GCbox-2 назад: 5’-TGAGGCAGGAGGAGGCTGC-3 ‘.

 

Флуоресцентная конфокальная микроскопия

Для получения и анализа изображений были использованы флуоресцентный конфокальный микроскоп (ZEISS710) и программное обеспечение для визуализации микроскопа ZEN (ZEISS). Процент клеток с точечной флуоресценцией GFP-LC3 рассчитывали.

 

Исследования на животных

Все исследования на животных проводились с одобрения Комитета по этике исследований на животных Китайского университета науки и техники. Для эксперимента с ксенотрансплантатом каждую группу клеток HepG2 (5 × 106) подкожно инъецировали голым мышам (SJA Laboratory Animal Company). В эксперименте по инъекции кетонового тела мышам вводили либо один физиологический раствор, либо физиологический раствор, содержащий β-HB (500 мг / кг), ежедневно, т.е. инъекции. Для эксперимента с кетогенной диетой мышей кормили в условиях кетогенной диеты (KD) или нормальной диеты (ND). Ингредиенты кетогенных диет показаны в дополнительной информации, таблица S6. Вес тела мыши, уровень глюкозы в крови и уровни β-HB контролировали в ходе экспериментов. Кровь мышей получали из зажимов для хвоста, а содержание глюкозы в крови и β-HB измеряли с использованием системы мониторинга глюкозы и кетона Free Style Optium (Abbott Diabetes Care Ltd., Великобритания). Объемы опухолей рассчитывали по следующей формуле: ширина (мм) × глубина (мм) × длина (мм) × 0,52.

 

Измерение уровня β-HB в сыворотке у нормальных субъектов и пациентов с ГЦК

Образцы сыворотки 29 нормальных субъектов и 35 пациентов с ГЦК были собраны отделением общей хирургии провинциальной больницы Аньхой. Для использования этих клинических материалов в исследовательских целях было получено письменное информированное согласие предыдущих пациентов и одобрение Комитета по этике институциональных исследований Провинциальной больницы Аньхой (утверждение № 201367). Β-HB в сыворотке измеряли с помощью набора для анализа β-HB (Cayman).

Клинический образец ткани человека

Нормальные ткани печени были собраны у пациентов, перенесших резекцию гемангиом печени в отделении гепатобилиарной хирургии, Первой дочерней больницы Университета Сунь Ятсена. Фиксированные формалином, включенные в парафин первичные образцы ГЦК, полученные от 158 пациентов, были случайным образом отобраны из архива Онкологического центра Университета Сунь Ятсена (Гуанчжоу, Китай). 20 спаренных очагов ГЦК и прилегающие неопухолевые клинические образцы тканей были отобраны у пациентов с ГЦК. Для использования этих клинических материалов в исследовательских целях было получено письменное информированное согласие пациентов и одобрение Комитета по этике институциональных исследований Онкологического центра Университета Сунь Ятсена. Клинические стадии опухоли были определены в соответствии с системой классификации Американского объединенного комитета по раку 2002 года / Международного союза по борьбе с раковыми опухолями / метастазами в лимфатических узлах / дистальными метастазами (TNM) 60.

 

IHC

Окрашивание IHC количественно анализировали с помощью компьютерной системы анализа изображений AxioVision Rel.4.6 с помощью программы автоматического измерения (Carl Zeiss, Oberkochen, Germany). Десять репрезентативных полей окрашивания каждого среза были проанализированы для проверки средней оптической плотности (MOD). Данные MOD были статистически проанализированы с помощью t-теста, чтобы сравнить среднюю разницу MOD между различными группами тканей.

 

статистический анализ

Связь между экспрессией OXCT1 и клинико-патологическими характеристиками анализировали с помощью теста X2. Кривые выживания строились по методу Каплана-Мейера и сравнивались с использованием теста логарифмического ранга. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение по меньшей мере трех независимых экспериментов. Статистическая значимость (P <0,05) оценивалась по критерию Стьюдента, если не указано иное.

 

Дополнительная информация, рисунок S1

Кетолиз повторно активируется в клетках ГЦК, испытывающих недостаток в питании.

 

Нажмите здесь для получения дополнительной информации. (250K, pdf)

Дополнительная информация, рисунок S2

OXCT1 имеет решающее значение для индукции кетолиза в клетках ГЦК, испытывающих недостаток в питании.

 

Нажмите здесь для получения дополнительной информации. (273K, pdf)

Дополнительная информация, рисунок S3

Активация передачи сигналов mTORC2-AKT-SP1 индуцирует экспрессию OXCT1 и кетолиз в клетках HCC, ограничивающих питание.

 

Нажмите здесь для получения дополнительной информации. (263K, pdf)

Дополнительная информация, рисунок S4

OXCT1 способствует прогрессированию ГЦК in vivo.

 

Нажмите здесь для получения дополнительной информации. (134K, pdf)

Дополнительная информация, рисунок S5

Аберрантная экспрессия OXCT1 предсказывает смертность пациентов при клиническом ГЦК.

 

Нажмите здесь для получения дополнительной информации. (60K, pdf)

Дополнительная информация, таблица S1

Клинико-патологическая характеристика клинических образцов и экспрессия OXCT1 при раке печени.

 

Нажмите здесь для получения дополнительной информации. (81K, pdf)

Дополнительная информация, таблица S2

Корреляция между экспрессией OXCT1 и клинико-патологическими характеристиками пациента с раком печени.

Дополнительная информация, таблица S3

Spearman Анализ корреляции между OXCT1 и клиническими характеристиками.

 

Нажмите здесь для получения дополнительной информации. (6.7K, pdf)

Дополнительная информация, таблица S4

Одномерный и многомерный анализ различных прогностических показателей у пациентов с раком печени с помощью регрессионного анализа Кокса.

 

Нажмите здесь для получения дополнительной информации. (79K, pdf)

Дополнительная информация, таблица S5

Нуклеотидная последовательность праймеров, используемая для количественной ПЦР в реальном времени.

 

Нажмите здесь для получения дополнительной информации. (20K, pdf)

Дополнительная информация, таблица S6

Состав кетогенных диет.

 

Нажмите здесь для получения дополнительной информации. (172K, pdf)

 

Рисунок 1

Кетолиз повторно активируется в клетках ГЦК с недостаточным питанием для облегчения пролиферации клеток. (A) Тепловая карта из анализа qRT-PCR показала экспрессию мРНК генов, связанных с метаболизмом липидов, в клетках HepG2, культивированных при голодании по глюкозе или глутамину или сыворотке в течение 24 часов, по сравнению с нормальными условиями культивирования. Желтый указывает на гены с повышенной активностью, тогда как синий указывает на гены с пониженной регуляцией. (B) Вестерн-блот анализ экспрессии BDH1, OXCT1 / 2 и ACAT1 в клетках HepG2 и Hep3B, культивируемых в нормальных условиях, при голодании в условиях глюкозы или глутамина или сыворотки в течение 48 часов. (C) Вестерн-блот-анализ экспрессии BDH1, OXCT1 и ACAT1 в клетках THLE3 и HepG2, культивированных в нормальных (0 ч) или в сывороточных условиях голодания (SS) в течение указанных часов. (D) ГХ-МС анализ 13 С-меченых метаболитов в клетках HepG2 и THLE3, культивируемых в нормальных условиях (Nor) или в сывороточном голодании (SS) в течение 48 часов, с последующей инкубацией с 5 мМ [2, 4-13C2] β-HB для 0, 1, 6, 12 и 24 ч. Данные были представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. * Р <0,05 по сравнению между указанными группами. (E) Принципиальная схема метаболического потока от кетолиза к циклу TCA, в которой метаболиты с [2, 4-13C2] β-HB-производными углеродами, измеренные в D, были отмечены красным. (F) Клеточные уровни АТФ измеряли в клетках HepG2 и THLE3, культивированных в нормальных условиях (Nor) или SS, в течение 48 часов с последующей инкубацией с 5 мМ экзогенного β-HB в течение 0, 1, 6, 12 и 24 часов. Значения были нормализованы для клеточного белка. Данные были представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. * P <0,05 по сравнению с группой Nor с 0 ч инкубацией β-HB. (G) Кривые роста клеток HepG2, культивируемых в присутствии или отсутствии 1 мМ или 5 мМ β-HB в нормальных (левая панель) или SS (правая панель) условиях. Стрелка указывает момент времени, когда SS начал. Количество клеток определяли подсчетом трипанового синего. Данные были представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. * Р <0,05 по сравнению между указанными группами.

Открыть в отдельном окне

фигура 2

OXCT1 имеет решающее значение для индукции кетолиза в клетках ГЦК, испытывающих недостаток в питании. (A) Клетки HepG2, стабильно экспрессирующие shРНК OXCT1 или нецелевой контроль (NTC), культивировали в нормальных условиях (Nor) или SS в течение 48 часов с последующей инкубацией с 5 мМ [2, 4-13C2] β-HB в течение 24 часов и последующее изотопное отслеживание 13C-меченых метаболитов методом ГХ-МС. Экспрессию OXCT1 определяли вестерн-блоттингом. Данные были представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. * P <0,05 по сравнению с группой, не культивированной с NTC; #P <0,05 по сравнению с группой, получавшей лечение NTC. (B) Средний β-HB измеряли в клетках HepG2, стабильно экспрессирующих BDH1, OXCT1 или пустой вектор (EV), после инкубации с 5 мМ экзогенного β-HB в течение указанных часов. Экспрессия OXCT1 и BDH1 определялась вестерн-блоттингом. Данные были представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. * Р <0,05 по сравнению между указанными группами. (C) Внутриклеточный AcAc измеряли после инкубации с или без 5 мМ экзогенного β-HB в течение 24 часов в клетках HepG2, стабильно экспрессирующих контроль BDH1, OXCT1 или EV. Значения были нормализованы для клеточного белка. Данные были представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. * P <0,05 по сравнению с группой EV без β-HB; #P <0,05 по сравнению с группой EV с лечением β-HB. (D, E) ГХ-МС анализ 13C-меченных метаболитов после инкубации с 5 мМ [2, 4-13C2] β-HB в течение 24 ч в клетках HepG2 (D) и Hep3B (E), стабильно экспрессирующих BDH1, OXCT1 или EV , Экспрессию BDH1 и OXCT1 в клетках Hep3B определяли вестерн-блоттингом. Данные были представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. * P <0,05 по сравнению с соответствующей группой EV. (F) Клеточные уровни АТФ измеряли в клетках HepG2, стабильно экспрессирующих shRNAs OXCT1 или NTC после обработки SS в течение указанных часов. Значения были нормализованы для клеточного белка. Данные были представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. * Р <0,05 по сравнению между указанными группами. (G) Кривые роста клеток HepG2, стабильно экспрессирующих shРНК OXCT1 (sh1 и sh2) или NTC, культивируемых в нормальных условиях или в условиях SS. Стрелка указывает момент времени, когда SS начал. Количество клеток определяли подсчетом трипанового синего. Данные были представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. * Р <0,05 по сравнению между указанными группами. (H) Клетки HepG2, стабильно экспрессирующие shRNA OXCT1 (нацеленные на 3’UTR), были дополнительно инфицированы вирусами, экспрессирующими pSIN-3 × flag-OXCT1 или pSIN-EV, с последующим измерением клеточного АТФ после обработки сывороточным голоданием (SS) в течение указанных часов. Значения были нормализованы для клеточного белка. Данные были представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. * Р <0,05 по сравнению между указанными группами. (I) Клетки HepG2, стабильно экспрессирующие shRNA OXCT1 (нацеленные на 3’UTR), были дополнительно инфицированы вирусами, экспрессирующими pSIN-3 × flag-OXCT1 или pSIN-EV. Клетки обрабатывали с или без SS, начиная с указанного стрелкой дня. Количество клеток определяли подсчетом трипанового синего. Данные были представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. * Р <0,05 по сравнению с указанной группой.

Открыть в отдельном окне

Рисунок 3

Активация передачи сигналов mTORC2-AKT-SP1 индуцирует экспрессию OXCT1 и кетолиз в клетках HCC, ограничивающих питание. (A) Вестерн-блот-анализ p-AMPK (фосфорилирование треонина 172 из AMPK), AMPK, p-AKT (фосфорилирование серина 473 из AKT), AKT, p-ERK1 / 2 (треонин 202 / фосфорилирование из тирозина 204 ERK1 / 2) Уровни ERK1 / 2, IκBα и NF-κB в клетках HepG2 при нормальных (0 ч) или условиях голодания в сыворотке в течение 6, 12 и 24 ч. (B) qRT-ПЦР и Вестерн-блот анализ экспрессии OXCT1 в клетках HepG2, инкубированных с наполнителем (ДМСО), соединением C (10 мкМ), LY-294002 (50 мкМ), PD98059 (50 мкМ), EVP4593 (1 мкМ) или Z-VAD-FMK (50 мкМ) в течение 2 ч до SS в течение 24 или 48 ч. Данные были представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. * P <0,05 по сравнению с нормальной группой, получавшей носитель; #P <0,05 по сравнению с группой SS, получавшей носитель. (C) Уровни белка AKT и OXCT1 определяли вестерн-блоттингом в клетках HepG2, стабильно экспрессирующих shRNAs AKT (sh1 и sh2) или NTC в нормальных условиях или в условиях SS в течение 48 часов. (D) Вестерн-блот анализ экспрессии OXCT1 в клетках HepG2, обработанных носителем (ДМСО) или 50 нМ рапамицина в течение 24 и 48 ч в присутствии или в отсутствие сыворотки. (E) Клетки HepG2, стабильно экспрессирующие shRNAs или NTC Rictor, культивировали в условиях Nor или SS в течение 48 часов. Экспрессию Rictor и OXCT1 определяли вестерн-блоттингом. (F) Вестерн-блот анализ экспрессии SP1 и OXCT1 в клетках HepG2, экспрессирующих shRNA или NTC SP1, или в клетках HepG2, предварительно обработанных наполнителем (ДМСО) или MIT (20 нМ) в течение 2 часов, в нормальных условиях или в условиях SS в течение 48 часов. (G) Вестерн-блот анализ уровней SP1 и OXCT1 в клетках HepG2, экспрессирующих pSIN-SP1 или pSIN-EV. (H) Клетки HEK293 котрансфицировали с помощью shRNAs SP1 и pGL2-OXCT1-промотор или репортерных векторов люциферазы pGL2-EV, и через 24 часа после трансфекции среду меняли на нормальную (Nor) или SS в течение еще 24 часов, с последующим двойным анализ люциферазы. Данные были представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. * Р <0,05 по сравнению между указанными группами. (I) Клетки HEK293 совместно трансфицировали pSIN-SP1 и pGL2-P-GCbox (GCbox-1/2 wt), pGL2-P-GCbox мутантами (GCbox-1/2 mt) или pGL2-P-EV-люциферазными векторами , Двойной люциферазный анализ проводили через 24 ч после трансфекции. Данные были представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. * Р <0,05 по сравнению между указанными группами. (J) Заполнение потенциального GC-бокса (GCBox-1/2) с помощью SP1 анализировали с помощью ChIP-анализа в клетках HepG2, культивируемых в нормальных условиях (Nor) или SS, в течение указанных часов с использованием антитела против SP1 или контроля IgG. Данные были представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. * P <0,05 по сравнению с соответствующей группой Nor. (K) Клетки HepG2, стабильно экспрессирующие shRNAs SP1 или NTC, были дополнительно инфицированы вирусами, экспрессирующими pBaBe-myr-flag-AKT (myr-AKT) или pBaBe-EV, с последующим вестерн-блот-анализом AKT1, p-SP1 (фосфорилирование треонина 453 SP1), уровни SP1 и OXCT1. (L) Схематическое изображение активированной сывороточным голоданием транскрипции OXCT1, опосредованной mTORC2, AKT и SP1. (M) Клетки HepG2, стабильно экспрессирующие shRNA AKT, shRNA SP1 или NTC, культивировали в условиях Nor или SS в течение 48 часов с последующей инкубацией с 5 мМ [2, 4-13C2] β-HB в течение 24 часов и последующей изотопной трассировкой 13C метаболитов с помощью ГХ-МС. Данные были представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. * Р <0,05 по сравнению с группой, получавшей НТК; #P <0,05 по сравнению с группой, получавшей лечение NTC.

Рисунок 4

Кетолиз подавляет активацию AMPK и аутофагию в клетках ГЦК с недостаточным питанием, повышая выработку АТФ. (A) Вестерн-блот анализ уровней OXCT1 и LC3-I / II в клетках HepG2, стабильно экспрессирующих shRNA или NTC OXCT1 в нормальных условиях или в условиях SS в течение 24 часов. (B) Клетки HepG2, стабильно экспрессирующие shRNA или NTC OXCT1, были дополнительно инфицированы вирусами, экспрессирующими pSIN-GFP-LC3, и культивировались в условиях Nor или SS в течение 24 часов. Процент клеток, демонстрирующих точечную флуоресценцию при флуоресцентной микроскопии, рассчитывали относительно всех GFP-позитивных клеток. Данные были представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. * Р <0,05 по сравнению с группой, получавшей НТК; #P <0,05 по сравнению с группой, получавшей лечение NTC. (C) Клетки HepG2, стабильно экспрессирующие shRNA OXCT1 (нацеленные на 3’UTR), были дополнительно инфицированы вирусами, экспрессирующими pSIN-3 × flag-OXCT1 или pSIN-EV. Каждую группу клеток обрабатывали наполнителем (ДМСО) или AICAR (1 мМ) в течение 2 часов до голодания сыворотки в течение 24 часов. Уровни белка OXCT1 и LC3-I / II определяли вестерн-блоттингом. (D) Клетки HepG2 в C были дополнительно инфицированы вирусами, экспрессирующими pSIN-GFP-LC3. Каждую группу клеток обрабатывали наполнителем (ДМСО) или AICAR (1 мМ) в течение 2 часов до голодания сыворотки в течение 24 часов. Процент клеток, демонстрирующих точечную флуоресценцию при флуоресцентной микроскопии, рассчитывали относительно всех GFP-позитивных клеток. Данные были представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. * Р <0,05 по сравнению с указанной группой. (E) Клетки HepG2, стабильно экспрессирующие shRNA OXCT1 (нацеливаясь на 3’UTR) или NTC, были дополнительно инфицированы вирусами, экспрессирующими pSIN-3 × flag-OXCT1 или pSIN-EV. Каждую группу клеток культивировали в нормальных (0 ч) или условиях голодания в сыворотке (SS) в течение 12 или 24 ч с последующим вестерн-блоттингом, анализируя уровни OXCT1, AMPK и p-AMPK. (F) Клетки HepG2, стабильно экспрессирующие shRNA или NTC OXCT1, культивировали в нормальных (0 ч) или SS условиях в течение 24 ч в присутствии или в отсутствие 5 мМ β-HB с последующим вестерн-блот-анализом OXCT1, AMPK, p-AMPK. и LC3-I / II. (G) Клетки HepG2 в F были дополнительно инфицированы вирусами, экспрессирующими pSIN-GFP-LC3. Клетки культивировали в условиях Nor или SS в течение 24 часов в присутствии или в отсутствие 5 мМ β-HB. Процент клеток, демонстрирующих точечную флуоресценцию при флуоресцентной микроскопии, рассчитывали относительно всех GFP-позитивных клеток. Данные были представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. * Р <0,05 по сравнению с указанной группой. (H) Клетки HepG2, стабильно экспрессирующие pSIN-3 × flag-OXCT1 или EV, были дополнительно инфицированы вирусами, экспрессирующими AKT shRNA или NTC. Клетки культивировали в нормальных условиях или в условиях SS в течение 24 часов с последующим вестерн-блоттингом, анализируя уровни AKT, OXCT1, AMPK, p-AMPK и LC3-I / II. (I) Клетки HepG2 в H были дополнительно инфицированы вирусами, экспрессирующими GFP-LC3. Каждую группу клеток культивировали в условиях Nor или SS в течение 24 часов. Процент клеток, демонстрирующих точечную флуоресценцию при флуоресцентной микроскопии, рассчитывали относительно всех GFP-позитивных клеток. Данные были представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. * Р <0,05 по сравнению с указанной группой.

Рисунок 5

OXCT1 способствует прогрессированию ГЦК in vivo. (A) Клетки HepG2, стабильно экспрессирующие OXCT1 или EV, инъецировали подкожно голым мышам (n = 5 для каждой группы). Рост опухолей измеряли, начиная с 9 дня после инокуляции, и опухоли извлекали и сравнивали в конце эксперимента. Показанные данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение. * P <0,05 по сравнению с группой EV. (B) Уровни белка OXCT1 и LC3-I / II определяли вестерн-блоттингом с использованием лизатов из пяти независимых опухолей каждой группы, как в A. (C) Клетки HepG2, стабильно экспрессирующие shRNA или NTC OXCT1, инъецировали подкожно мышам-голым ( n = 5 для каждой группы). Рост опухолей измеряли, начиная с 9 дня после инокуляции, и опухоли извлекали и сравнивали в конце эксперимента. Показанные данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение. * Р <0,05 по сравнению с группой NTC. (D) Уровни белка OXCT1 и LC3-I / II определяли вестерн-блоттингом с использованием лизатов из пяти независимых опухолей каждой группы, как в C. (E) Клетки HepG2, стабильно экспрессирующие OXCT1 или EV, подкожно инъецировали голым мышам (n = 5 для каждой группы). Начиная с инокуляции мышам вводили либо физиологический раствор, либо физиологический раствор, содержащий β-HB (500 мг / кг), ежедневно, т.е. инъекции. Рост опухоли измеряли, начиная с 9 дня после инокуляции. Опухоли были извлечены и сравнены в конце эксперимента. Показанные данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение. * Р <0,05 по сравнению между указанными группами. (F) Уровни белка OXCT1 и LC3-I / II определяли вестерн-блоттингом с использованием лизатов опухолевых тканей из каждой группы, как в E.

Рисунок 6

Аберрантная экспрессия OXCT1 предсказывает смертность пациентов при клиническом ГЦК. (A) Уровни β-HB в сыворотке измеряли у 29 нормальных субъектов (n = 29) и 35 пациентов с ГЦК (n = 35). Данные были представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. * P <0,001 по сравнению между двумя группами. (B) уровни мРНК OXCT1 определяли с помощью qRT-PCR в 20 парах клинически подобранной опухоли, прилегающих к незлокачественным тканям печени (нормальная) и тканям ГЦК человека (опухоль). Данные были представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (n = 20). * Р <0,05 по сравнению между двумя группами. (C) уровни p-SP1, SP1 и OXCT1 определяли вестерн-блоттингом с использованием парной опухоли, прилегающей к незлокачественным тканям печени (нормальная) и тканям ГЦК человека (опухоль). (D) Показан репрезентативный IHC-анализ экспрессии OXCT1 в нормальных тканях печени (в норме) и в образцах ГЦК различных клинических стадий (I-IV). (E) Статистическая количественная оценка значений средней оптической плотности (MOD) окрашивания OXCT1 в анализе IHC между нормальными тканями печени и образцами ГЦК различных клинических стадий (I-IV). MOD окрашивания OXCT1 увеличивается по мере прогрессирования ГЦК до более высокой клинической стадии. Данные были представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. * Р <0,05 по сравнению с нормальной контрольной группой. (F) кривые Каплана-Мейера с одномерными анализами для пациентов с низкой и высокой экспрессией OXCT1; n = 79 для каждой группы.

Рисунок 7

Кетолиз, вызванный недостатком питания, подавляет аутофагию, способствуя прогрессированию рака печени. Схематически показано, что, в отличие от нормальных клеток печени, ГЦК может использовать кетоновые тела, вырабатываемые самими раковыми клетками, нормальными клетками печени или другими потенциальными источниками из микроокружения опухоли. Механистически, индуцированная голоданием в сыворотке экспрессия OXCT1 посредством передачи сигналов mTORC2-AKT-SP1 способствует катаболизму кетонового тела с целью повышения клеточных уровней АТФ в клетках HCC, что ингибирует активацию AMPK и защищает клетки рака печени от чрезмерной аутофагии в условиях ограничения питания.

 

1.

Активация онкогенов и потеря опухолевых супрессоров способствуют метаболическому перепрограммированию при раке, что приводит к усиленному поглощению питательных веществ для обеспечения энергетических и биосинтетических путей. Однако для ограничения питательных веществ в солидных опухолях может потребоваться, чтобы злокачественные клетки проявляли метаболическую гибкость для поддержания роста и выживания. Здесь мы выделяем эти адаптивные механизмы, а также обсуждаем новые подходы к исследованию метаболизма опухоли in vivo и их потенциал для дальнейшего расширения метаболического репертуара злокачественных клеток.

2. рассматривают как растут раковые клетки на ферментации

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2849637/

Understanding the Warburg Effect: The Metabolic Requirements of Cell Proliferation. . Упоминается, что «

Опухолевые клетки человека, рост которых обусловлен онкогеном MYC, особенно чувствительны к выведению глютамина (31), а гены, участвующие в метаболизме глутамина, находятся под прямым и косвенным контролем транскрипции белка MYC (32, 33). Истощение глутамина из трансформированных MYC клеток приводит к быстрой потере промежуточных продуктов цикла TCA и гибели клеток (31). Кроме того, эта зависимость от глютамина для выживания не связана с образованием АТФ в результате метаболизма глютамина.» Также пишут, что в пролиферации клеток все сложнее, чем сначала думали, и, скорее, много неизвестного.

3. Про необходимые питательные вещества для роста раковой опухоли.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4676726/

Жирные кислоты необходимы для пролиферации, потому что они необходимы для образования новых клеточных мембран. Синтез жирных кислот требует генерации цитозольного ацетил-КоА, который преимущественно происходит из митохондриального цитрата, который расщепляется АТФ-цитрат-лиазой в цитозоле. При нормоксии (нормальных уровнях глюкозы) этот цитрат получают из глюкозы через пируват, который превращается в митохондриальный ацетил-КоА пируватдегидрогеназой. Однако в условиях гипоксии пируватдегидрогеназа инактивируется пируватдегидрогеназы киназой, и происходит восстановительное карбоксилирование глютамина в цитрат. Хотя многие раковые клетки синтезируют жирные кислоты de novo из ацетил-КоА, некоторые полагаются на внешние источники. Kamphorst et al. Установлено, что гипоксия или экспрессия онкогенных RAS также увеличивает импорт жирных кислот в форме лизолипидов.

4.

Здесь мы опишем эксперименты, указывающие, что некоторые опухоли, возможно, развили зависимость от ацетата как источника углерода для производства ацетил-КоА. Опыты на мышах и дрожжевых культурах, на клеточных культурах

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4272450/

Ацетил-КоА представляет собой центральный узел метаболизма углерода, который играет ключевую роль в биоэнергетике, пролиферации клеток и регуляции экспрессии генов. Насколько гликолитические или гипоксические опухоли способны продуцировать достаточные количества этого метаболита для поддержания роста и выживания клеток в условиях ограничения питательных веществ, остается недостаточно понятным.

5. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25525870 Ацетат — топливо для роста рака

   https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4374602/

Циркулирующий свободный ацетат образуется в результате ферментации углеводов в кишечнике комменсальными анаэробами и печенью в кетогенных условиях (с низким содержанием глюкозы) в качестве конечного продукта окисления жирных кислот или метаболизма этанола у пьющих.

Чтобы опухолевая клетка метаболизировала ацетат, клетка должна активировать ACSS2, фермент, необходимый для превращения ацетата в ацетил-КоА, как показано при гепатоцуллярной карциноме

9.Кетоновые тела как сигнальные метаболиты

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4374602/

Традиционно β-гидроксибутират тела кетона (βOHB) рассматривался как переносчик энергии от печени к периферическим тканям во время голодания или физических упражнений. Однако βOHB также передает сигналы через внеклеточные рецепторы и действует как эндогенный ингибитор гистондеацетилаз (HDAC). Эти последние данные подтверждают модель, в которой βOHB функционирует, чтобы связать окружающую среду, в данном случае диету, и экспрессию генов посредством модификаций хроматина. Здесь мы рассмотрим регуляцию и функции кетоновых тел, связь между кетоновыми телами и ограничением калорий, а также последствия ингибирования HDAC кетоновым телом βOHB в модуляции метаболизма и заболеваний старения.

16. Recently, we investigated the metabolic adaptation of human hepatocellular carcinoma (HCC) cells under various stress conditions16,17,18.

16. Исследование клеточных культур рака

17.Нет полного текста, про один из метаболических путей рака в эффекте Варбурга

18. Исследования in vitro раковых клеток, не пациентов и in vivo на мышах.


Augmentation effect of postprandial hyperinsulinaemia on growth of human hepatocellular carcinoma

Abstract

Background: Cirrhotic patients with hepatocellular carcinoma (HCC) frequently have impaired glucose metabolism.

Aims: To investigate whether impaired glucose metabolism affects the growth rate of the tumour.

Patients and methods: Tumour doubling time (DT), assessed by ultrasound imaging analysis, was measured in 60 patients with single small HCC (diameter <30 mm). DT was compared with plasma insulin and glucose concentrations following the oral glucose tolerance test (OGTT). The effect of continuous infusion of octreotide (a somatostatin analogue 200 μg/day) for three months on DT in five cases was assessed.

Results: The 60 patients were divided into two groups because the median DT was 140 days: rapid growth group (DT ≤140 days, n=30) and slow growth group (DT >140 days, n=30). Fasting plasma insulin concentration and area under the plasma insulin curve (AUCins) of the OGTT (10.4 (6.2) μU/ml and 262 (152) μU/ml/h, respectively; mean (SD)) in the rapid growth group were significantly higher than those in the slow growth group (7.6 (4.3) and 146 (140), respectively) (p=0.041 and p=0.0006, respectively). In contrast, fasting plasma glucose concentration and area under the plasma glucose curve (AUCgluc) in the rapid growth group were significantly lower than those in the slow growth group (p=0.0003 and p=0.0012, respectively). Univariate and multivariate analyses of logistic regression models demonstrated that AUCins was a significant factor contributing to the growth rate of HCC (p=0.001 and p=0.016, respectively). AUCins significantly decreased after octreotide treatment (p<0.02) but AUCgluc did not significantly change. DT after treatment increased in three of the five patients and could not be calculated in the remaining two patients because of no change in the diameter of the tumour.

Conclusions: These data suggest that postprandial hyperinsulinaemia is associated with accelerated HCC growth.


Higher glucose and insulin levels are associated with risk of liver cancer and chronic liver disease mortality among men without a history of diabetes

Abstract

Insulin resistance likely increases the risk of chronic liver disease (CLD) and liver cancer, but long-term prospective studies with measured fasting glucose and insulin are lacking. We evaluated the associations of pre-diagnostic fasting glucose, insulin and the homeostasis model assessment of insulin resistance (HOMA-IR) with liver cancer and CLD mortality in a prospective study of Finnish male smokers with extended follow-up time (≤22 years) and information on known risk factors using data from 138 incident primary liver cancer cases 216 CLD deaths and 681 matched controls. Fasting glucose and insulin were measured in baseline serum. We used unconditional logistic regression to estimate odds ratios (ORs) and 95% confidence intervals (CI) adjusted for age, alcohol, education, smoking, body mass index, and hepatitis B and C viral status. Among those without self-reported diabetes, glucose was positively associated with liver cancer (Quartile 3 vs. Quartile 1 (Q3/Q1): OR=1.88, 1.03–3.49; Q4/Q1: OR=2.40, 1.33–4.35, P-trend=.002), and undiagnosed, biochemically defined, diabetes was associated with higher risk of liver cancer (OR=2.95, 1.46–5.96) and CLD mortality (OR=1.88, 1.00–3.56). Serum insulin and HOMA-IR were also positively associated with liver cancer (Q4/Q1: OR=3.41, 1.74–6.66, P-trend<.0001; OR=3.72, 1.89–7.32, P-trend<.0001, respectively) and CLD (OR=2.51, 1.44–4.37, P-trend=.0002; OR=2.31, 1.34–3.97, P-trend=.001, respectively), with stronger associations observed for liver cancer diagnosed >10 years after baseline. In conclusion, elevated fasting glucose and insulin, and insulin resistance were independently associated with risk of liver cancer and CLD mortality, suggesting a potentially important etiologic role for insulin and glucose dysregulation even in the absence of diagnosed diabetes.


Yongxia Qiao,1Xiao Zhang,2Yue Zhang,3Yulan Wang,2Yanfeng Xu,4Xiangfan Liu,5Fenyong Sun,2and Jiayi Wang2,6High Glucose Stimulates Tumorigenesisin Hepatocellular Carcinoma CellsThrough AGER-DependentO-GlcNAcylation of c-JunDiabetes 2016;65:619–632 | DOI: 10.2337/db15-1057Epidemiologic studies suggest that hepat

High Glucose Stimulates Tumorigenesis in Hepatocellular Carcinoma …

 

diabetes.diabetesjournals.org/content/diabetes/65/3/619.full.pdf
by Y Qiao — ‎2016 — ‎Cited by 17 — ‎Related articles

important risks in progression of hepatocellular carcinoma. (HCC) (1,2). As the ….. STZ-induced insulin deficiency could be reversed by intraperitoneal injection …

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *